Многоканальная флуоресценция — это метод микроскопического анализа, при котором используется несколько флуорофоров (меток), каждый из которых излучает свет на своей длине волны. Это позволяет одновременно наблюдать и анализировать несколько компонентов в одном и том же образце: например, ядра клеток, митохондрии и белковые маркеры.
Olympus BX53 — это исследовательский микроскоп, предназначенный для рутинных и специализированных флуоресцентных задач. Его система позволяет точно подбирать фильтры, использовать различные источники света и получать чёткие, стабильные изображения при работе с несколькими каналами. Это особенно важно в молекулярной биологии, онкологии, нейробиологии и клинической диагностике.
Установка фильтров и подбор источника освещения
Ключ к успешной многоканальной флуоресценции — это правильный выбор фильтров и источника света, который будет возбуждать флуорофоры, не создавая перекрёстных помех.
Выбор флуоресцентных кубов:
BX53 поддерживает до 6–8 фильтровых кубов, каждый из которых состоит из:
- Возбуждающего фильтра (excitation)
- Дихроичного зеркала (dichroic mirror)
- Излучающего фильтра (emission)
Для работы с наиболее распространёнными метками можно использовать следующие фильтры:
- DAPI — возбуждение 360–400 нм, излучение 450–470 нм
- FITC / GFP — возбуждение 470–490 нм, излучение 510–540 нм
- TRITC / RFP / Texas Red — возбуждение 540–560 нм, излучение 580–620 нм
- Cy5 / Alexa 647 — возбуждение 630–650 нм, излучение 665–700 нм
- Мультиспектральные фильтры — позволяют снимать несколько меток без ручной смены куба
Фильтры должны быть строго согласованы с длинами волн используемых красителей, чтобы исключить наложение каналов и паразитную флуоресценцию.
Выбор источника света:
- Металлогалогенные лампы — мощный и стабильный источник для большинства задач. Требуют прогрева.
- LED-модули — низкий уровень нагрева, длительный ресурс, возможность быстрого переключения каналов.
- Лазерные источники (опционально) — для максимально точного возбуждения в продвинутых системах.
Все необходимые компоненты для настройки Olympus BX53 — включая фильтры, источники света и адаптеры — можно заказать.
Как настроить параметры экспозиции и интенсивности света
Четкое и информативное изображение возможно только при правильно выставленных параметрах съёмки. Не менее важно при этом сохранить флуоресцентные метки и избежать переэкспонирования.
Этапы настройки:
- Настройка яркости источника
Начинайте с минимального значения, увеличивайте до появления стабильного сигнала. Лучше дольше экспозиция, чем слишком яркий свет. - Экспозиция (exposure)
Для слабых флуорофоров — 500–1000 мс, для ярких — до 100 мс. Избегайте "засветки" (clipping) и пустых теней. - Усиление (gain)
Используйте минимальное значение, чтобы не вносить шум в изображение. При необходимости — компенсируйте длительностью экспозиции. - Автоматические и ручные режимы
Лучше использовать ручной режим для каждого канала отдельно. Это обеспечивает точную настройку и стабильность. - Съёмка по каналам
Не снимайте все каналы сразу — выставляйте настройки поочередно, чтобы адаптировать параметры к каждому красителю. - Баланс белого и калибровка камеры
Выполняется в ПО. При правильной калибровке изображение будет соответствовать реальной окраске флуорофоров.
Все эти действия позволяют получить изображение, пригодное как для анализа, так и для научных публикаций.
Как избежать фотодеструкции и откалибровать фильтры
Фотодеструкция (выцветание) — это деградация флуорофоров под воздействием избыточного света. Чтобы сохранить метки и не исказить данные, необходимо строго контролировать условия освещения и правильно эксплуатировать оптику.
Как защитить образцы:
- Используйте anti-fade среды
Препараты, содержащие DABCO или специальные буферы, замедляют фотодеструкцию. - Включайте свет только при съёмке
Микроскоп может быть оснащён моторизованным затвором — свет включается только в момент съёмки. - Фильтруйте свет через ND-фильтры
Они уменьшают интенсивность излучения без смещения спектра. - Используйте минимальные экспозиции
Не настраивайте камеру в live view на длительное время — это приводит к выгоранию даже при умеренном свете.
Калибровка фильтров:
- Убедитесь в чистоте оптических поверхностей — даже лёгкая пыль может исказить спектр.
- Периодически сравнивайте работу фильтра с эталонным препаратом.
- Используйте стандартные люминесцентные микрослайды (например, с GFP) для визуальной оценки яркости и контрастности.
Эти меры помогут сохранить качество изображений и достоверность результатов в течение всего эксперимента.
Обзор программного обеспечения и методы анализа изображений
Последний этап — анализ. Цифровая обработка позволяет не только визуализировать, но и количественно оценить распределение флуоресценции, сравнить интенсивность, посчитать объекты.
Рекомендуемое ПО:
- Olympus CellSens
Полная интеграция с BX53. Позволяет управлять камерой, переключать каналы, накладывать изображения и производить измерения. - ImageJ / Fiji
Бесплатная, модульная система. Поддерживает плагины для колокализации, 3D-реконструкции, анализа интенсивности. - ZEN (Carl Zeiss), NIS Elements (Nikon) — сторонние платформы, совместимы при использовании универсальных форматов изображений (TIFF, OME-TIFF).
Инструменты анализа:
- Колокализация флуорофоров
Определение перекрытия сигналов в двух и более каналах. - Псевдоокрашивание
Назначение каждому каналу уникального цвета для визуальной идентификации. - Интенсивностный анализ
Измерение плотности сигнала в выбранных областях ROI. - Автоматический подсчёт объектов
Используется при исследовании клеточной плотности, делений, меток апоптоза и пр.
Для надёжной аналитики важна не только аппаратная часть, но и корректная настройка рабочих процессов.
